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May 30, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 46 (2023) Citar este artículo

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Las imágenes de fase cuantitativa (QPI) tridimensionales (3D) permiten obtener imágenes tomográficas sin etiquetas a largo plazo y análisis cuantitativos de bacterias individuales vivas. Sin embargo, el movimiento browniano o la motilidad de las bacterias en un medio líquido produce artefactos de movimiento durante las mediciones 3D y dificulta el análisis y la obtención de imágenes celulares precisas. Mientras tanto, los métodos de inmovilización celular existentes producen ruidos de fondo e incluso alteran la fisiología celular. Aquí, presentamos un protocolo que utiliza hidrogeles para QPI 3D de alta calidad de bacterias vivas que mantienen la fisiología bacteriana. Demostramos imágenes cuantitativas de alta resolución a largo plazo y análisis de bacterias individuales, incluida la medición de los parámetros biofísicos de las bacterias y las respuestas a los tratamientos con antibióticos.

El monitoreo a largo plazo de las bacterias es una tarea vital en las industrias de la salud, la bioingeniería y las ciencias biológicas. En entornos clínicos, identificar bacterias patógenas y determinar antibióticos eficaces contra las bacterias son procesos cruciales en el tratamiento de enfermedades infecciosas1,2,3. Además, la ingeniería de bacterias para la producción eficiente de biomateriales es un campo de investigación activo4,5. Las bacterias también se han utilizado como organismos modelo para comprender los mecanismos celulares debido a su simplicidad6,7,8. Sin embargo, la mayoría de los enfoques convencionales para el estudio de bacterias tienen una sensibilidad limitada porque dependen de las propiedades masivas de las colonias bacterianas o de soluciones de alta concentración. Para identificar bacterias patógenas, se requiere un cultivo microbiano que requiere mucho tiempo para asegurar señales suficientes en dispositivos de detección basados ​​​​en espectrometría de masas9. Recientemente, se han desarrollado y utilizado técnicas unicelulares avanzadas para investigar bacterias individuales10,11,12. En particular, la identificación y el análisis de bacterias a nivel unicelular se han demostrado en varios estudios13,14,15.

La imagen de fase cuantitativa (QPI) es una técnica de imagen sin etiquetas que se ha explotado en diversos estudios biológicos16. QPI permite imágenes de alto contraste y sin etiquetas midiendo el retardo de fase óptica de la luz dispersa16. Al permitir investigaciones a nivel unicelular, QPI se ha utilizado para estudiar células sanguíneas17,18, células cancerosas19,20,21, virus SARS-CoV-222, tejidos23,24 y bacterias13,25,26. Debido a su capacidad de obtención de imágenes cuantitativas de alta resolución y sin etiquetas, se han utilizado técnicas de QPI 2D para el estudio de bacterias. Las bacterias se estudian con más detalle utilizando QPI tridimensional (3D), que reconstruye la tomografía del índice de refracción (RI) 3D a partir de múltiples mediciones 2D de luz dispersa. 3D QPI facilita la identificación de bacterias a nivel unicelular13, el estudio de la respuesta de la terapia fotodinámica antimicrobiana27, el seguimiento cuantitativo de la síntesis de polímeros en bacterias28 y la investigación en intervalos de tiempo de bacterias tratadas con antibióticos25.

Sin embargo, la medición de imágenes QPI de bacterias individuales va acompañada de dificultades experimentales. Una de esas dificultades es el movimiento browniano y la motilidad de las bacterias en un ambiente líquido, que inducen el movimiento. La adquisición de imágenes 3D de alta calidad se ve dificultada en un medio líquido porque la motilidad bacteriana genera artefactos de imagen y prohíbe mediciones a largo plazo [Fig. 1a]. Debido a que 3D QPI reconstruye una tomografía RI a partir de múltiples mediciones 2D, la calidad de la imagen cae drásticamente con los cambios en la geometría de la muestra durante las mediciones. Además, durante las mediciones a largo plazo, las bacterias suelen viajar desde sus ubicaciones originales y, en ocasiones, fuera del campo de visión (FOV).

(a) Mediciones QPI de bacterias en diferentes ambientes. La calidad de la imagen se reduce por la motilidad bacteriana y el ruido de fondo en un medio líquido y una almohadilla de agar, respectivamente. Un entorno a base de hidrogel previene ambos problemas. (b) Esquema del sistema ODT. DMD: dispositivo de microespejo digital.

Varios estudios han sugerido técnicas de inmovilización para evitar problemas relacionados con la motilidad al medir bacterias individuales. Una técnica utiliza poli-l-lisina, que se utiliza frecuentemente para facilitar la adhesión celular a superficies de plástico o vidrio29. Sin embargo, la alteración fisiológica de las bacterias debido a la poli-l-lisina restringe la utilidad de esta técnica30. Otra técnica de inmovilización bacteriana es la almohadilla de agar31,32,33. Sin embargo, cuando se aplica a 3D QPI, una almohadilla de agar produce imágenes ruidosas [Fig. 1] debido a la distribución no homogénea de RI en una almohadilla de agar.

Para lograr mediciones QPI 3D de bacterias sin problemas inducidos por el movimiento ni ruido de fondo, proponemos un método experimental que utiliza un hidrogel para mejorar la calidad de las imágenes. Los hidrogeles son polímeros hidrófilos reticulados que forman matrices extracelulares ópticamente transparentes y son materiales adecuados para abordar los problemas antes mencionados34,35. Aquí, demostramos experimentalmente un método para obtener imágenes de bacterias utilizando sustratos de hidrogel y tomografía de difracción óptica (ODT), una técnica QPI 3D. Nuestro método logra una mayor calidad de imagen y una inmovilización estable de la muestra en comparación con el uso de un medio líquido o un entorno de almohadilla de agar. Además, nuestro método facilita análisis a largo plazo de las características celulares y la investigación de la respuesta a los antibióticos. Basado en las ventajas destacadas en nuestro estudio, nuestro método proporciona una técnica auxiliar de alta calidad para el estudio de bacterias individuales.

Para validar la capacidad de obtención de imágenes del entorno basado en hidrogel en 3D, comparamos las imágenes QPI en 3D de bacterias individuales obtenidas en un medio líquido, almohadilla de agar e hidrogel [Fig. 2]. Primero, validamos que un medio líquido y un hidrogel tienen valores de RI de fondo idénticos, lo que hace que la reconstrucción y el análisis comunes estén disponibles para mediciones basadas en hidrogel. Verificamos experimentalmente la distribución homogénea de fondo RI del medio líquido y de hidrogel comparando los mapas de retardo de fase de perlas de SiO2 de 2 μm, que se encuentran en ambos medios [Figura complementaria S1].

Visualización MIP de tomografías RI 3D de K. pneumoniae en líquido (a), almohadilla de agar (b) e hidrogel (c).

El artefacto de movimiento en el entorno basado en hidrogel se redujo drásticamente en comparación con el del entorno líquido. En medios líquidos, una gran cantidad de bacterias exhibieron movimiento durante la medición, produciendo artefactos de movimiento. La propiedad de este movimiento en medios líquidos se especificó aún más mediante el análisis de las trayectorias de lapso de tiempo de bacterias individuales [Figura complementaria S2]. En este análisis, K. pneumoniae exhibió un movimiento aleatorio con una difusividad estimada de 0,302 ± 0,091 μm2/s, mientras que E. coli exhibió un movimiento relativamente activo, que resuena con las propiedades de motilidad conocidas de las dos especies37. Debido al movimiento antes mencionado, los límites de las tomografías RI 3D resultantes en un medio líquido quedaron oscurecidos [Fig. 2a, las flechas amarillas y el vídeo complementario. 1].

Las tomografías RI 3D medidas en entornos inmovilizadores mostraron una reducción significativa en el movimiento, así como en el artefacto resultante [Fig. 2b,c]. Las tomografías de RI de las bacterias en la almohadilla de agar mostraron un ruido de fondo moteado, lo que implica una distribución no homogénea de los RI en la almohadilla de agar [Fig. 2b y vídeo complementario. 2]. Por el contrario, el entorno de hidrogel pudo proporcionar un contraste claro y sin artefactos [Fig. 2c y vídeo complementario. 3]. Para respaldar aún más la capacidad de inmovilización de bacterias del hidrogel, calculamos la viscosidad de un medio líquido y un medio de hidrogel, que fueron 0,001 ± 0,000 Pa∙s y 0,286 ± 0,120 Pa∙s, respectivamente. Por lo tanto, nuestro protocolo basado en hidrogel facilita un perfilado más preciso de bacterias individuales sin la necesidad de una tediosa curación de datos. Para los análisis restantes en medios líquidos, utilizamos tomografías seleccionadas sin artefactos de movimiento para abordar otros problemas, incluidos el ruido de fondo y la motilidad.

Examinamos el nivel de ruido de fondo de la imagen 3D QPI y el grado de inmovilización de las bacterias en el entorno líquido, de almohadilla de agar y de hidrogel [Fig. 3]. Se midieron tomografías RI 3D durante 1,5 h en cada entorno medio y se visualizaron utilizando MIP con la bacteria correspondiente centrada en la imagen. K. pneumoniae en el medio líquido viajó y giró [Fig. 3a], mientras que las bacterias en la almohadilla de agar y el hidrogel se fijaron, lo que permitió monitorear el crecimiento en diferentes direcciones [Fig. 3b,c]. El entorno de hidrogel permite una visualización y mediciones confiables del crecimiento y la división bacteriana. El incremento del ruido de fondo con el tiempo se debe a la inestabilidad mecánica y la alteración del estado medio.

Time-lapse de visualización MIP de tomografías RI 3D de K. pneumoniae en diferentes medios: medio líquido (a), almohadilla de agar (b) e hidrogel (c). A los 0 minutos, se indican tanto las vistas 3D de la proyección máxima de RI como los volúmenes marcados con cuadrados blancos que se utilizan para calcular y visualizar la distribución de fondo de RI como en (d). (d) Diagrama de caja para el nivel de ruido de fondo en diferentes medios; medio líquido, almohadilla de agar e hidrogel. El nivel de ruido de fondo se evaluó a partir de 40 × 40 × 40 píxeles sin muestras en cada tomografía. Estas regiones se indican con contornos blancos en (a – c). Los errores cuadráticos medios (MSE) de los fondos se calcularon en nueve tomografías para cada medio por separado. La marca central indica la mediana y los bordes inferior y superior del cuadro indican los percentiles 25 y 75, respectivamente. Los bigotes se extienden hasta los puntos de datos más extremos que no se consideran valores atípicos, y los valores atípicos se trazan utilizando el símbolo '+'.

Además, analizamos la distribución RI del fondo calculando el error cuadrático medio (MSE) [Fig. 3d]. Los valores medios de MSE para un medio líquido, una almohadilla de agar y un hidrogel fueron 1,69 × 10−7, 1,31 × 10−6 y 1,99 × 10−7, respectivamente. Los valores p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon fueron 0,0013, 0,0023 y 0,7175 para líquido y almohadilla de agar, para almohadilla de agar e hidrogel, y para líquido e hidrogel, respectivamente. Aquí, los valores de MSE del fondo para un sistema de hidrogel son comparables con los del medio líquido con un valor p alto. En comparación, el sistema de almohadilla de agar registró los valores más altos de MSE de los RI de fondo. Los resultados muestran que el hidrogel es un sistema apropiado para la inmovilización de bacterias manteniendo los niveles de ruido dentro del rango del medio líquido. Este nivel de ruido reducido del hidrogel también puede conducir a un seguimiento más preciso de las características cuantitativas, incluida la densidad de masa seca, en comparación con la almohadilla de agar. Es decir, debido a la relación lineal entre el incremento de RI y la densidad de masa seca, la variación en las características cuantitativas se puede suprimir con una medición precisa de RI.

Luego comparamos la división bacteriana en el ambiente del hidrogel y en el medio líquido para evaluar el efecto del hidrogel en la fisiología de las bacterias [Fig. 4]. No se observaron cambios fisiológicos drásticos, ya que el tiempo de duplicación de las bacterias en los dos ambientes no varió significativamente. En particular, investigamos la morfología celular y la distribución del tiempo de duplicación de K. pneumoniae en el medio líquido y en diversas concentraciones del hidrogel [Fig. 4]. Adquirimos tomografías RI a intervalos de 1 minuto y medimos el crecimiento y la división bacteriana en las imágenes MIP. Para el análisis morfológico se eligieron los puntos de tiempo en la división y 3 minutos antes y después de la división [Fig. 4a]. Las imágenes MIP muestran que las bacterias conservan morfologías similares, crecen hasta un tamaño fijo y se reproducen mediante fisión binaria sin alteraciones anormales en todas las condiciones.

(a) Visualización MIP de tomografías RI 3D de K. pneumoniae en división a lo largo del tiempo en diferentes medios: un medio líquido, un hidrogel al 70 %, un hidrogel al 80 % y un medio de hidrogel al 90 %. (b) Distribución del tiempo de duplicación de K. pneumoniae en los diferentes medios. (c) Distribuciones de densidad de masa seca para K. pneumoniae a 0 min en varios medios. Para (b) y (c), se dan los resultados del valor p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon del líquido y de los entornos de hidrogel combinados.

En un paso sucesivo se obtuvo el tiempo de duplicación de K. pneumoniae para determinar cuantitativamente los efectos del hidrogel sobre el metabolismo biológico. Se investigaron los eventos de división de 57, 50, 61 y 53 bacterias para cada entorno de medio: medio líquido, hidrogel al 70 %, hidrogel al 80 % y hidrogel al 90 %. Para mejorar la precisión, realizamos tres exámenes separados para cada condición.

Las distribuciones del tiempo de duplicación de K. pneumoniae en los distintos medios fueron comparables. El promedio y la desviación estándar del tiempo de duplicación de K. pneumoniae en el medio líquido, hidrogel 70%, hidrogel 80% e hidrogel 90% fueron 30,75 ± 4,58 min, 34,42 ± 6,95 min, 30,20 ± 3,98 min y 29,53 ± 4,13 min. , respectivamente [Fig. 4b]. El valor p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para el líquido y los medios de hidrogel combinados fue de 0,49, lo que indica similitud estadística. Además, calculamos las distribuciones de densidad de masa seca de las bacterias a 0 min en un medio líquido, una almohadilla de agar, hidrogel al 70%, hidrogel al 80% y hidrogel al 90% para validar aún más el estado fisiológico constante de las bacterias en los hidrogeles [Fig. 4c]. Se calcularon un total de 99, 28, 91, 28 y 68 bacterias para un medio líquido, una almohadilla de agar, hidrogel al 70%, hidrogel al 80% y hidrogel al 90%, donde los valores promedio y de desviación estándar de las distribuciones de densidad de masa seca fueron 11,83. ± 0,71 g/dL, 9,14 ± 0,54 g/dL, 11,75 ± 0,73 g/dL, 12,04 ± 0,56 g/dL, 11,53 ± 1,01 g/dL, respectivamente. La distribución de la densidad de masa seca de las bacterias en un medio líquido fue comparable a las distribuciones de masa seca agrupadas de las bacterias en hidrogel al 70%, hidrogel al 80% y hidrogel al 90% con el valor p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de 0,3 [Fig. 4c]. Por el contrario, la distribución de la densidad de masa seca de las bacterias en una almohadilla de agar representa una disminución en comparación con las demás, con un valor p de la prueba de suma de rangos de Wilcoxon de 8,30 × 10-36 entre un entorno de medio líquido. También observamos que la precisión de la medición de la masa seca está directamente relacionada con la precisión experimental de RI y la resolución de la imagen, que son decisivas para la densidad de masa seca y el volumen, respectivamente.

Nuestro protocolo basado en hidrogel facilitó el seguimiento de 1,5 h de una sola bacteria, permitiendo la investigación de características morfológicas y bioquímicas a lo largo del tiempo. Se recuperaron y analizaron las siguientes características celulares mediante tomografías RI 3D: masa seca celular, volumen y área de superficie. Los cambios temporales en estas características se representaron para evaluar cuantitativamente el crecimiento bacteriano tanto en el medio líquido como en el de hidrogel [Fig. 5b,d].

Visualización MIP y análisis cuantitativo de tomografías RI 3D de K. pneumoniae en medio líquido (a,b) e hidrogel (c,d). El análisis cuantitativo incluye masa seca celular, volumen y área de superficie extraída de cada tomografía instantánea. (a,c) M1 y M2 se refieren a las células madre, mientras que D11, D12 y D21, D22 se refieren a dos células hijas de cada célula madre. En (a), se puede ver una célula hija (D21) en la esquina superior derecha saliendo del campo de visión a los 71 min. (b) Los puntos temporales que muestran caídas repentinas en la masa seca celular de K. pneumoniae están marcados con líneas discontinuas rojas. En (d), se presentan datos agrupados de todas las células hijas y análisis unicelulares.

El crecimiento de K. pneumoniae se pudo seguir continuamente en el medio de hidrogel al 80%; esto fue difícil de lograr en el medio líquido debido a la motilidad bacteriana. Los valores de las características celulares en el medio líquido muestran caídas bruscas en determinados puntos [Fig. 5b]. Una revisión de las imágenes adquiridas mostró dos casos que dificultaban las mediciones continuas de crecimiento en el medio líquido. En el primer caso, la motilidad y rotación de las células hijas dificultaba rastrear sus orígenes. En el segundo caso, una de las células hijas salió del campo de visión [Fig. 5a, D21 a los 71 min]. Por el contrario, el medio de hidrogel se convierte en un entorno práctico para rastrear y analizar continuamente las características celulares. Las bacterias son rastreables y están bien inmovilizadas para todas las células hijas [Fig. 5c]. Por lo tanto, las características celulares agrupadas de las células hijas en el medio de hidrogel mostraron un aumento constante sin caídas repentinas. Además, fue factible el análisis de las características de cada célula hija en el hidrogel [Fig. 5d]. Las características celulares de las células hijas individuales muestran claramente dos divisiones celulares consecutivas, mientras que el análisis de las características de los grupos de células puede facilitar potencialmente el diagnóstico.

Finalmente, demostramos la posible aplicación del hidrogel como medio de obtención de imágenes para pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (AST) basadas en imágenes38,39 [Fig. 6]. Tratamos K. pneumoniae y E. coli con 200 μg/ml de ampicilina en medio de hidrogel al 80 % y medimos tomografías RI 3D durante 90 minutos para evaluar si el entorno basado en hidrogel es adecuado para evaluar las respuestas bactericidas25.

(a) Visualización MIP de tomografías RI 3D de K. pneumoniae (a) y E. coli (b) tratadas con 200 μg/ml de ampicilina. Se trazaron análisis cuantitativos de masa seca (c) y densidad de masa seca (d) a lo largo del tiempo para K. pneumoniae y E. coli.

Como resultado del tratamiento con ampicilina se identificaron alteraciones de K. pneumoniae en las propiedades bioquímicas y morfológicas. En primer lugar, el tratamiento con ampicilina provocó una caída inmediata de la densidad de masa seca. La densidad de masa seca en un medio de hidrogel al 80% tratado con ampicilina a los 0 min disminuyó significativamente a 10,33 g/dL [Fig. 6c] mientras que en un medio de hidrogel al 80% sin ampicilina tuvo un valor promedio de 12,04 ± 0,56 g/dL [Fig. 4c]. Además, se observó un alargamiento prolongado de K. pneumoniae. Incluso después del tiempo suficiente para la división celular, la longitud de la célula siguió aumentando sin división, como se muestra en las imágenes MIP [Fig. 6a, 63 minutos]. También fue visible la formación de un bulto RI alto en el medio de la célula [Fig. 6a, 89 min], lo cual ha sido reportado en estudios previos como resultado de la transpeptidasa inhibida40,41.

La Figura 6b muestra el MIP de una única E. coli tratada con ampicilina. Con el tiempo, se puede detectar una formación de abultamiento sin incremento en los valores de masa seca [Fig. 6b, 60 min y Fig. 6c]40. Basándonos en estas observaciones, llegamos a la conclusión de que el hidrogel se puede utilizar con éxito para obtener imágenes de las respuestas físicas de las bacterias a los antibióticos.

Proponemos y demostramos un protocolo para QPI 3D de bacterias que no sufre artefactos inducidos por el movimiento ni ruido de fondo. Nuestro protocolo utiliza hidrogel como parte del medio de carga y se beneficia de la formación de matrices extracelulares ópticamente claras34,35. El hidrogel facilita mediciones QPI 3D de alta calidad de bacterias al inmovilizarlas sin generar ruido. Además, las características fisiológicas de las muestras en un sistema de hidrogel son invariables y fácilmente accesibles para su análisis, como lo indica nuestro análisis estadístico del tiempo de duplicación y la densidad de masa seca. El entorno biocompatible y estable creado por nuestro protocolo permitió mediciones cuantitativas a largo plazo. Otros experimentos también sugieren la viabilidad de nuestro protocolo en aplicaciones prácticas, como la medición de la eficacia de los antibióticos en un entorno de hidrogel basado en 3D QPI. Creemos que nuestro protocolo facilitaría las aplicaciones en las que la medición de la morfología 3D es crucial, como se ilustra a continuación.

La identificación de bacterias patógenas es una aplicación potencial del método propuesto. El cultivo microbiano, que requiere mucho tiempo, es un obstáculo para el tratamiento temprano con antibióticos apropiado debido a la necesidad de disponer de datos conjuntos sobre el comportamiento de innumerables bacterias ante los antibióticos42. Las técnicas unicelulares, incluido el QPI, ayudan a superar esta limitación midiendo las respuestas de bacterias individuales13,43. Y nuestro método puede respaldar la identificación bacteriana con QPI al proporcionar un entorno más estable para las mediciones. Nuestro método se puede aplicar aún más en un proceso de imágenes de alta calidad para la identificación de muestras de bacterias basada en QPI. Un estudio anterior ha demostrado la rápida identificación de bacterias utilizando QPI 3D y aprendizaje profundo13, y creemos que nuestro protocolo puede impulsar la adquisición de datos y mejorar el rendimiento de dichas técnicas al reducir los artefactos de movimiento y permitir imágenes a largo plazo. Además, la clasificación de bacterias basada en biomarcadores también será viable utilizando nuestro método43, ya que proporciona una adquisición más estable de biomarcadores, incluida la masa seca y el volumen. Por lo tanto, nuestro protocolo impulsará el QPI 3D para una rápida identificación bacteriana.

El estudio de las respuestas bacterianas en diferentes ambientes es otro campo al que nuestro protocolo puede contribuir. Una aplicación práctica de este método es AST. La AST se utiliza para evaluar la resistencia a los antibióticos de bacterias específicas. Esta información es crucial para que los médicos determinen los tipos de antibióticos utilizados para el tratamiento de infecciones44. La AST tradicional utiliza información poblacional de bacterias para medir su susceptibilidad a los antibióticos45. Nuestro protocolo se puede implementar no solo para AST24 basado en la población, sino también para evaluar la susceptibilidad a los medicamentos de bacterias individuales, lo que se ha indicado como una alternativa rápida a los enfoques convencionales que requieren mucho tiempo28. Un método AST de bacterias individuales sin etiquetas comercializado evalúa muestras en un entorno a base de agarosa mediante microscopía de campo brillante. Este método tiene la ventaja de obtener imágenes sin etiquetas, pero aún implica un retraso de un día debido al requisito de incubación46,47. Este largo tiempo de respuesta no está presente en AST basado en QPI 3D debido a la alta sensibilidad y accesibilidad a las propiedades biofísicas cuantitativas. Al visualizar la morfología, el QPI 3D proporciona mayor contraste y sensibilidad que la microscopía de campo brillante, ya que las células suelen inducir más difracción que absorción en la longitud de onda visible. Además, el QPI 3D proporciona no solo información morfológica como lo hace la microscopía de campo brillante, sino también información cuantitativa adicional, incluida la distribución de RI, la masa seca y la densidad de masa seca, que son adecuadas para análisis unicelulares como la muerte celular48. Utilizando nuestro enfoque, la monitorización 3D QPI de bacterias individuales puede revelar la susceptibilidad a los antibióticos en aproximadamente una hora. La aplicación de nuestro método en QPI 3D es especialmente eficiente cuando se trata de AST para bacterias no cultivables o difícilmente cultivables. Por ejemplo, Treponema pallidum subsp. pallidum y Synergistetes, que son los principales agentes causantes de la sífilis y las enfermedades periodontales49,50, son difíciles de cultivar en los laboratorios ya que requieren condiciones de cultivo únicas y prolongadas, reactivos especiales y cocultivo con líneas celulares específicas. Esas bacterias se pueden probar de manera eficiente en tiempo y recursos mediante el análisis preciso de bacterias individuales con 3D QPI y nuestro protocolo. Por lo tanto, imaginamos que nuestro protocolo puede acelerar la AST sin etiquetas al eliminar la necesidad de procedimientos de cultivo que requieren mucho tiempo. Además, se puede lograr un AST más eficiente basado en 3D QPI y nuestro método mediante la introducción de técnicas de microfluidos. Al formar gradientes de fármacos en un chip de microfluidos, se puede facilitar una AST en el chip basada en la monitorización QPI 3D.

Nuestro método también puede beneficiar los estudios de síntesis de biopolímeros microbianos al monitorear cuantitativamente los niveles de producción de cada célula. Las bacterias pueden utilizarse como fábricas de células para biopolímeros, que luego se utilizan en aplicaciones médicas e industriales4. Al monitorear los niveles de producción de biopolímeros individuales de forma no invasiva, se pueden aplicar condiciones más eficientes para la producción de biopolímeros a nivel médico e industrial28.

Además, nuestro protocolo puede ayudar en estudios de mecanismos celulares de bacterias individuales. El análisis unicelular con QPI 3D basado en nuestro protocolo permitiría el fenotipado de bacterias individuales dependiendo de los estados de sus mecanismos celulares. Poblaciones bacterianas aparentemente uniformes para investigación pueden diferir en los estados del ciclo celular y las subpoblaciones genotípicas y fenotípicas de sus vecinas51. Nuestro método puede facilitar la investigación de la fisiología celular heterogénea con resolución de una sola bacteria al proporcionar un análisis estable a largo plazo tanto para la morfología cualitativa como para la información cuantitativa de RI de células vivas individuales16,52.

Planeamos investigar ampliamente la capacidad de nuestro método. Aunque medimos cada muestra en 1,5 h, con un mantenimiento más preciso de la temperatura y la humedad, sería posible una investigación mucho más larga. Además, se puede implementar un entorno a base de hidrogel en un tiempo más corto utilizando diferentes composiciones poliméricas, como ya sugieren varios estudios53,54. Para utilizar ampliamente el método propuesto para AST, se debe investigar la influencia del hidrogel en la difusión de antibióticos55. Es poco probable que la ampicilina, que se utilizó en nuestra demostración, se vea impedida durante la difusión debido a su pequeño peso molecular. Sin embargo, estudios recientes también han sugerido antibióticos macromoleculares, cuya dinámica de difusión puede variar debido a entornos de malla como el hidrogel56.

Las cepas bacterianas Klebsiella pneumoniae (aislados clínicos del Banco Asiático de Bacterias de la Fundación Asia Pacífico para Enfermedades Infecciosas) y Escherichia coli (ATCC25922) se almacenaron en un congelador a -70 °C. Se agregaron cinco microlitros de la muestra bacteriana a 1000 μL de caldo de soja tríptico (TSB; MBcell) y se incubaron durante 1 h a 37 °C en una incubadora con agitación con CO2 al 5%. La mezcla estabilizada (100 µL) se extendió sobre placas de agar tríptico de soja (TSA) y se incubó durante 24 h a 37 °C en una incubadora con 5% de CO2. Las placas TSA se almacenaron a 4 °C y se utilizaron en el plazo de una semana. Antes de los experimentos, se seleccionó una colonia, se resuspendió en 1000 μL de TSB y se incubó durante 24 h a 37 °C en una incubadora con agitación con CO2 al 5%.

Los hidrogeles se formaron mediante la combinación de HyStem y Extralink (HYS020, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EE. UU.) con una proporción de volumen de 4:1. HyStem y Extralink son hialuronano modificado con tiol y entrecruzadores reactivos con tiol, respectivamente. HyStem y los cultivos bacterianos se incubaron en un baño de agua a 37 °C antes de su uso. Para la muestra de hidrogel al 70 %, mezclamos 14 μL de HyStem, 7,5 μL de cultivo bacteriano y 3,5 μL de Extralink en un tubo Eppendorf (EP) y 14 μL de HyStem, 7,5 μL de TSB y 3,5 μL de Extralink en otro. Tubo EP. Para la muestra de hidrogel al 80%, mezclamos 16 μL de HyStem, 5 μL de cultivo bacteriano y 4 μL de Extralink en un tubo EP y 16 μL de HyStem, 5 μL de TSB y 4 μL de Extralink en otro tubo EP. Para la muestra de hidrogel al 90%, mezclamos 18 μL de HyStem, 2,5 μL de cultivo bacteriano y 4,5 μL de Extralink en un tubo EP y 18 μL de HyStem, 2,5 μL de TSB y 4,5 μL de Extralink en otro tubo EP. Luego colocamos un cubreobjetos de 20 mm × 20 mm en un TomoDish (Tomocube Inc., Daejeon, Corea), presionamos suavemente solo los lados del vidrio para asegurarlo e incubamos la cámara en una placa caliente a 37 °C. Se agregaron diez microlitros de cada tubo EP a cada ranura lateral del TomoDish. Finalmente, se selló la cámara añadiendo 10 μL de aceite mineral a las ranuras. TomoDish se incubó durante 10 minutos en una placa caliente a 37 °C para solidificar completamente el hidrogel. Se requirieron aproximadamente 20 minutos para la preparación de la muestra en un medio de hidrogel, incluida la incubación para la solidificación de un hidrogel. HyStem y Extralink se almacenaron a -20 °C cuando no estaban en uso.

Las almohadillas de agar son geles de agarosa que se solidifican en formas cúbicas delgadas. En este caso, adoptamos el protocolo estándar de oro para la obtención de imágenes de bacterias en una almohadilla de agar, en el que las bacterias se asientan entre una almohadilla de agar en la parte inferior y un cubreobjetos de vidrio en la parte superior57,58,59. Preparamos un parafilm de 20 mm × 20 mm y extirpamos un orificio cuadrado de 12 mm × 12 mm. El parafilm se colocó en un TomoDish y se fijó mediante fusión parcial en una placa caliente a 70 °C. Se vertió gel de agarosa al 1,5% completamente derretido (214010, BD, Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU.) sobre el TomoDish y se cubrió con un cubreobjetos. Una vez que el gel de agarosa se solidificó por completo, se retiró el cubreobjetos sin generar desgarros ni arrugas en la almohadilla de agar. A continuación, se dejaron caer 5 µL de una muestra sobre la almohadilla de agar, que luego se cubrió suavemente con un cubreobjetos nuevo. Finalmente, la cámara se selló agregando 10 μL de aceite mineral a las ranuras y se incubó durante 10 minutos en una placa caliente a 37 °C. Se necesitaron aproximadamente 30 minutos para la preparación de la muestra en una almohadilla de agar, incluida la incubación.

Para adquirir una tomografía RI 3D de la bacteria, utilizamos un instrumento ODT (HT-2H, Tomocube Inc., Daejeon, Corea) con una cámara de imágenes de células vivas (Tomochamber, Tomocube Inc., Daejeon, Corea del Sur) que proporciona una humedad ambiente y mantiene la temperatura y la concentración de CO2 de la muestra a 37 °C y 5%, respectivamente. La variabilidad en el RI del agua se puede expresar con una ecuación empírica junto con el cambio de temperatura y coeficientes empíricos, pero es insignificante en nuestras condiciones de medición60,61. Este sistema óptico se basa en un microscopio interferométrico Mach-Zehnder con un dispositivo de microespejo digital (DMD) para controlar el ángulo del haz de muestra [Fig. 1b]62. Se dividió un rayo láser coherente (λ = 532 nm en el vacío) en haces de muestra y de referencia utilizando un acoplador de fibra óptica monomodo 2 × 2. El DMD controla el ángulo del haz de muestra que incide sobre una muestra. El tiempo de exposición de la imagen es de alrededor de 0,15 s considerando 49 patrones DMD y 3,019 ms de tiempo de obturación de la cámara. El haz difractado por una muestra se visualiza en el plano de la cámara, donde interfiere con el haz de referencia. Utilizando el algoritmo de recuperación de fase, se recuperaron las imágenes de fase y amplitud de cada interferograma. La distribución 3D RI se reconstruyó a partir de varios hologramas 2D de la muestra desde diferentes ángulos de iluminación y resolviendo inversamente la ecuación de Helmholtz con la aproximación de Rytov. Las resoluciones espaciales lateral y axial calculadas teóricamente del sistema de imágenes ópticas fueron 110 nm y 360 nm, respectivamente63. Debido a la apertura numérica limitada de los condensadores y las lentes del objetivo, no se recolectaron señales de dispersión lateral, lo que provocó una degradación de la calidad de la imagen de las tomografías RI 3D reconstruidas. Para resolver este problema de cono faltante, se utilizó un algoritmo de regularización iterativo basado en una restricción no negativa64. El código detallado de implementación y reconstrucción fue el publicado anteriormente65,66.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por el programa KAIST UP, el programa BK21+, Tomocube Inc., la Fundación Nacional de Investigación de Corea (2015R1A3A2066550, 2022M3H4A1A02074314), la subvención del Instituto de Creación de Valor Tecnológico de KAIST, el Centro de Enlace con la Industria (Proyecto G-CORE) financiada por el Ministerio de Ciencia. y subvención ICT (N11230131), Instituto de Planificación y Evaluación de Tecnologías de la Información y las Comunicaciones (IITP; 2021-0-00745) financiada por el gobierno de Corea (MSIT).

Estos autores contribuyeron igualmente: Jeongwon Shin y Geon Kim.

Departamento de Ciencias Biológicas, Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST), Daejeon, 34141, Corea del Sur

Jeongwon Shin

Departamento de Física, Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST), Daejeon, 34141, Corea del Sur

Geon Kim, Parque Jinho, Moosung Lee y Parque YongKeun

Instituto KAIST de Ciencia y Tecnología de la Salud, Instituto Avanzado de Ciencia y Tecnología de Corea (KAIST), Daejeon, 34141, Corea del Sur

Geon Kim, Moosung Lee y YongKeun Park

Tomocube Inc., Daejeon, 34051, Corea del Sur

Parque Yong Keun

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JS y JP realizaron experimentos. JS, GK y ML analizaron los datos. YP concibió y supervisó el proyecto. Todos los autores escribieron el manuscrito.

Correspondencia al parque YongKeun.

M. Lee y YK Park tienen intereses financieros en Tomocube Inc., una empresa que comercializa tomografía por difracción óptica e instrumentos de imágenes de fase cuantitativa y es uno de los patrocinadores del trabajo. Los demás autores no declaran tener intereses financieros en competencia.

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Shin, J., Kim, G., Park, J. et al. Evaluaciones a largo plazo sin etiquetas de bacterias individuales mediante imágenes de fase cuantitativa tridimensionales e inmovilización basada en hidrogel. Representante científico 13, 46 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-27158-y

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Recibido: 13 de septiembre de 2022

Aceptado: 27 de diciembre de 2022

Publicado: 02 de enero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-27158-y

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